索拉非尼/索拉菲尼可以作为解偶联剂

　　肝癌细胞对索拉非尼的不敏感严重限制了癌症治疗的结果。在我们的研究中，长期使用3种浓度索拉非尼的HepG2细胞，包括LI72h、MI72h和HI72h，HepG2细胞对索拉非尼不敏感。这些存活的细胞不属于连续暴露于不断增加的索拉非尼浓度的HepG2细胞产生的索拉非尼耐药。因为HI72h细胞分化的子细胞对索拉非尼的IC50值与索拉非尼处理前未处理的HepG2细胞相似。为了探索潜在的生存机制，我们首先对不同浓度索拉非尼在癌细胞中的细胞内作用进行了大规模的蛋白质组学分析。　　

　　采用基于tmbased的定量方法，在LI72h、MI72h和HI72hHepG2细胞中共鉴定和定量了4100个蛋白；茎干分析显示两个最丰富的簇；在这些簇中，520个蛋白在3种类型的细胞中被索拉非尼显著且浓度依赖性地上调。KEGG通路对520个蛋白的显著定量变化的分析表明，其中80个蛋白涉及最可靠的“代谢通路”，主要与中心碳代谢有关，包括碳代谢、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、TCA循环等。具体地说，这80个蛋白质的蛋白质相互作用分析表明，大多数的33个蛋白质之间的相互作用与线粒体和12的蛋白质参与OXPHOS。　　

　　通过对520个调控蛋白的GO富集分析，102个线粒体蛋白显著富集(p=7.77-21)。通过基于这520个蛋白的转录因子(TF)预测，我们确定了几个TFs，如NRF1和YY1，线粒体基因的典型上游调节因子，可能负责增加sorafenib治疗后的蛋白表达响应。因此，这些蛋白质组学结果表明，102个线粒体蛋白在LI72h、MI72h和HI72hHepG2细胞中呈递增性上调；其中12个蛋白与线粒体OXPHOS密切相关，可能参与了索拉非尼抗肿瘤活性存活机制的形成。　　

　　因此，我们推测HCC细胞可能通过重塑线粒体呼吸功能而在大剂量索拉非尼的抗肿瘤活性作用下存活。基于这个假设，我们评估的影响与索拉非尼long-term-treatment细胞线粒体的呼吸功能，心肌梗死和嗨细胞48h和72h。尽管许多upregulation线粒体蛋白质索拉非尼治疗后，嗨肝癌细胞的细胞线粒体呼吸功能明显，非常有说服力地抑制，这个发现是完全无法预料的。值得注意的是，HI72h细胞在维持最低基础呼吸几乎等于最大呼吸水平的情况下，仍保持了继代培养后的粘附和增殖能力。　　

　　HI72h细胞分化子细胞的线粒体呼吸功能与未处理的HepG2细胞相似(数据未显示)。由于我们的定量蛋白质组学数据显示，LI72h、MI72h和HI72h细胞的线粒体呼吸链蛋白水平呈浓度依赖性升高，这一矛盾提出了线粒体呼吸链蛋白上调可能是为了弥补线粒体功能受到的严重抑制。Eimre等人[33]报道了wfs1缺陷小鼠肌肉中类似的现象，线粒体蛋白增加，这可能弥补了线粒体质量的下降。　　

　　为了更详细的调查等，我们使用高分辨率呼吸测量来阐明潜在的线粒体呼吸抑制或补偿机制。LI、MI、HI细胞实验中索拉非尼浓度与临床相关；因此，我们研究了与IC20、IC50或IC80浓度相对应的索拉非尼短期治疗对HepG2细胞的影响。短期sorafenib显著抑制CIOXPHOS容量和ETS容量，并呈浓度依赖性，最大抑制分别为59.7%和79.2%(p<0.01)。Bull等人使用了一种测定NADH氧化为NAD+的方法，该方法间接反映了人神经母细胞瘤细胞的CI活性，并认为索拉非尼损害了CI活性。　　

　　此外，我们发现索拉非尼可以作为解偶联剂；本研究中有两种证据支持这一结论。首先，与海马实验中质子泄漏升高的结果相一致的是，与时间匹配的对照组相比，使用浓度为IC80的索拉非尼短期治疗导致CI的泄漏呼吸增加4倍，泄漏呼吸增加2倍。由于泄漏呼吸主要是补偿质子泄漏后抑制ATP合酶。其次，在用IC80浓度索拉非尼处理15分钟的HepG2细胞中，滴定获得最大解耦能力的FCCP的最佳浓度降低了2倍。有报道称，某些线粒体解偶联剂能够通过促进质子穿过线粒体内膜泄漏来减少OXPHOS的偶联，从而中断依赖于CIV与CV偶联的ATP的产生。总之，索拉非尼特异性靶向线粒体CI，解除线粒体OXHPOS，导致OXHPOS功能的整体抑制。　　

　　与选择性抑制CIOXPHOS容量相反，索拉非尼治疗诱导了CIIOXPHOS容量的代偿性增加，且呈浓度依赖性。在蛋白质组学分析中，这种补偿与CII组分(SDHB)的上调一致，可能在索拉非尼的抗肿瘤作用中发挥重要的保护癌细胞的作用。呼吸链的线粒体CII具有连接ETC和TCA循环的双重作用，bb0和CII抑制剂通过其促凋亡和抗血管生成的潜力显示出良好的抗癌活性；该化合物已被证明与抗癌剂协同诱导癌细胞的多效性反应。　　

　　考虑到索拉非尼对OXPHOS和ETS功能的过度抑制，大部分代偿表达的线粒体蛋白无法支持呼吸和能量供应，尤其是在高剂量索拉非尼治疗的情况下。糖酵解是另一个主要的生物能量途径，参与填补ATP生产的空白。OCR和ECAR分别被称为OXPHOS和糖酵解的指标，OCR/ECAR的相对比值经常被用作潜在代谢转换的指标。　　

　　通常，OCR/ECAR比率超过1表明倾向于线粒体OXPHOS，而低于1表明倾向于糖酵解。从能量代谢的角度，索拉非尼(IC20IC50，IC80)显著，LI72hconcentration-dependently抑制糖酵解代谢MI72hHI72h细胞证实索拉非尼是一种有效的全球能量代谢的抑制因子在肝癌细胞。然而，HI72h细胞显示显著降低基底OCR值相比HI48h细胞(HepG2和Huh7细胞减少77.2%和43.8%)，但仍等于ECAR价值。我们还观察到，与HI48h细胞相比，HI72h细胞的基底OCR/ECAR比率降低，表明HI细胞更依赖糖酵解来维持其能量需求。同样，KEGG通路分析显示，糖酵解通路中涉及的某些蛋白浓度依赖性上调。先前的研究报道，24小时后，sorafenib浓度小于10°M时，可以抑制HepG2细胞中的OXPHOS，但不抑制糖酵解，证实了sorafenib的优先目标是线粒体功能。　　

　　因此，我们有理由认为，HI72h细胞通过线粒体OXPHOS到糖酵解的代谢转换，避免了高剂量索拉非尼的抑制作用，代谢重编程能够提供基本的ATP支持肿瘤细胞存活。因此，为了证实代谢重编程是否能够支持不敏感细胞的存活，我们研究了2-DG联合索拉非尼长期治疗的效果。正如预期的那样，2-DG能使肝癌细胞对索拉非尼诱导的细胞死亡敏感，并与索拉非尼协同。甚至解释了最近观察到索拉非尼联合沉默HK2增加了肝癌细胞死亡并协同抑制肿瘤生长的机制。　　

　　综上所述，我们首次证明了索拉非尼（索拉菲尼），一种fda批准的治疗HCC的药物，通过两种不同的机制显著抑制人类HCC细胞线粒体OXPHOS:直接针对ci连接的电子传输和OXPHOS能力，以及作为潜在解耦器阻断ATP的产生与呼吸耦合。然而，仍有一定数量的HCC细胞对索拉非尼的长期治疗不敏感，即使是在药物浓度最高的情况下，这些细胞通过代谢重编程存活，包括对生物能量通路蛋白的广泛代偿调节。　　

　　首先，主要的重编码被确认为大量线粒体蛋白的代偿性增加，特别是在ETS组分中，包括CI亚基表达水平的维持和CII丰度和活性的增加，这可能绕过索拉非尼对CI电子传输的抑制。另一机制包括，当OXPHOS被高剂量索拉非尼抑制时，代谢从OXPHOS转变为糖酵解，从而维持能量供应，支持癌细胞存活。索拉非尼治疗下ETS成分的异常敏感性和稳定的剂量依赖性补偿，特别是复合物I和II亚基的上调，可能是预测索拉非尼治疗后药物反应和预后的可靠指标。索拉非尼效果好吗？详情请扫码咨询：