维奈托克/威托克在FL中的活性

　　卵泡淋巴瘤(FL)中的染色体易位t(14；18)是导致BCL-2过表达的主要致癌事件。本研究旨在研究靶向BCL-2的BH3拟维奈托克（威托克）(ABT-199)的活性以及FL的获得性耐药机制。　　

　　FL细胞对维奈托克（威托克）治疗的敏感性与BCL-2/BIM比值相关。抗凋亡蛋白表达相似但BIM水平较高的细胞对治疗更敏感。维奈托克（威托克）诱导BCL-2/BIM复合物解离和线粒体电位下降。有趣的是，维奈托克（威托克）处理后存活的细胞数量显示p-ERK1/2和p-BIM(S69)增加，同时BIM总水平下降。维奈托克（威托克）耐药细胞最初出现p-AKT和p-Foxo1/3a水平升高，BIM/BCL-2/BECLIN1复合物解离，SQSTM1/p62水平下降(提示自噬升高)，BIM表达略有下降。建立稳定的抗性细胞系后，BCL-2水平显著降低，BIM几乎完全消失。　　

　　选择性抑制ERK/AKT或抗cd20抗体治疗可防止这些耐药表型的产生，因此，对FL患者可能采用联合治疗。　

　

　　滤泡性淋巴瘤(FL)是美国最常见的惰性b细胞淋巴瘤。FL的特征是t易位(14；18)(q32；q12)，其抑制了BCL-2表达，增加了FL细胞的凋亡阈值。　　

　　BCL-2家族促凋亡和抗凋亡蛋白表达失衡与多种肿瘤类型的发生和化疗耐药有关。这可能是高水平表达的抗凋亡蛋白的结果，这些蛋白通过隔离仅bh3的促凋亡蛋白(如BIM、PUMA和NOXA)来阻止细胞死亡，并限制凋亡的激活。在这种情况下，抗凋亡蛋白的上调和与激活蛋白的结合有利于细胞存活。　　

　　ABT-737及其口服活性模拟药navitoclax(ABT-263)是BH3模拟药，已在临床单药和联合试验中进行测试。维奈托克（威托克）(ABT-199)是第二代BCL-2家族抑制剂，其对BCL-XL的影响小得多，因此可以最小化治疗相关性血小板减少，这是navitoclax早期试验的剂量限制毒性。维奈托克（威托克）单独和联合应用于CLL和[7]淋巴瘤的临床试验正在进行中。FL中的t(14；18)易位使这种恶性肿瘤成为BH3模拟物的合理靶点。虽然维奈托克（威托克）在FL患者中显示了单药活性，但总体的反应率没有CLL患者高。　　

　　因此，通过识别潜在的预测生物标志物、耐药机制以及可能预防或克服耐药的治疗组合原理，了解维奈托克（威托克）在FL中的体外和体内活性可以帮助临床开发。由于缺乏具有代表性的FL细胞系和合适的动物模型，这一领域的研究一直受到阻碍。在本研究中，我们使用了来自白血病期FL患者WSU-FSCCL和转化FL患者FC-TxFL2的患者样本和t(14；18)阳性细胞系。同时，通过对维奈托克（威托克）的连续处理，建立了维奈托克（威托克）耐药细胞系，探讨其耐药机制。　　

　　尽管BCL-2在FL中过表达，但早期临床试验显示，维奈托克（威托克）作为单一药物在FL中的活性低于CLL患者中的活性。我们还观察到，在一组一级FL样本中，单剂对维奈托克（威托克）的敏感性存在差异，并发现这种敏感性与BCL-2/BIM比率相关。同样，当分析BCL-2水平相似的两株t(14；18)阳性细胞株WSU-FSCCL和FC-TxFL2时，观察到对维奈托克（威托克）的敏感性与BIM水平之间具有可比性。此外，这些细胞具有相同水平的抗凋亡蛋白如BCL-XL和mcl1，以及类似水平的促凋亡蛋白如BAX、BAK、BID、BOK、BAD和NOXA。这些数据证实了在骨髓瘤细胞系和小鼠淋巴亚群中BIM基因沉默或BIM缺失分别降低了ABT-737或维奈托克（威托克）的活性的早期工作。维奈托克（威托克）介导BCL-2/BIM复合物的解离，导致t(14；18)阳性FL细胞caspase依赖性凋亡，并与JNK、ERK和AKT通路的激活相关　　

　　相应地，在FL-txfl2异种移植模型中，维奈托克（威托克）明显延迟了肿瘤的生长。这一效应是剂量依赖的，但与再生长相关，仅提供了大约10天的总生存率增加，这可能反映了临床观察到的FL的维奈托克（威托克）较低的活性。当从FC-TxFL2肿瘤中分离出来的细胞用维奈托克（威托克）治疗时，与仅用载体治疗的细胞相比，之前在体内用维奈托克（威托克）治疗的细胞的耐药性增加了两周。实验结果表明，FL细胞在较短的时间内就能获得对维奈托克（威托克）的抗性。然而，当细胞在不含维奈托克（威托克）的培养基中保存两周后，抗性消失，表明处理假期可能会使FL细胞重新敏感。　　

　　为了发现细胞在体外适应急性维奈托克（威托克）治疗的证据，我们对在维奈托克（威托克）治疗后从存活的、非凋亡的FC-TxFL2细胞中分离的蛋白进行了westernblot分析。与经汽车处理的FC-TXFL2细胞相比，这些细胞表现出更高水平的活性ERK1/2、磷酸化BIM(S69)和更低的总BIM水平。我们知道当BIM在丝氨酸69上磷酸化时，它通过蛋白酶体途径[20]迅速降解。综上所述，这些数据表明ERK通路在降低FC-TxFL2细胞中维奈托克（威托克）诱导的凋亡率方面的潜在作用。事实上，当细胞用ERK抑制剂SCH772984预处理时，发现维奈托克（威托克）诱导的细胞凋亡显著增强。ERK通路抑制剂索拉菲尼(sorafinib)抑制BCL-2诱导的细胞凋亡也有类似的增强作用。　　

　　长期/低浓度维奈托克（威托克）治疗可诱导FC-TxFL2细胞中JNK1/2和AKT通路的激活，这可以通过磷酸化状态的增加来证明。使用SP600125抑制JNK1/2通路或使用PI3K抑制剂BKM120抑制AKT通路可使FC-TxFL2细胞对维奈托克（威托克）敏感。虽然我们最初认为JNK1/2的激活主要是由细胞凋亡引起的，但随着数据的增加，我们发现该通路在细胞凋亡/自噬平衡中发挥着重要作用。首先，检测到p-JNK1/2/BIM水平的适度升高，表明BIM的凋亡功能受到了抑制。其次，在JNK1/2磷酸化的情况下，观察到BIM/BECLIN1、BCL2/BECLIN1解离和SQSTM1/p62降解等自噬激活的事件。关于维奈托克（威托克）治疗后自噬激活的详细研究超出了本研究的范围；然而，先前使用ABT-737的研究表明，自噬可能在细胞适应BH3模拟物中发挥重要作用。AKT通路在获得性耐药中的重要性最近也有发表。AKT可磷酸化BIM表达的转录因子Foxo3a蛋白，负调控BIM表达。本研究中，当PI3-kinaseinhibitorBKM120抑制AKT通路时，发现磷酸化的Foxo1/3a蛋白显著下降。虽然BKM120预处理没有增加BIM总量，但显著增强了维奈托克（威托克）对细胞凋亡的诱导作用。　　

　　为了进一步研究获得性抗性，两个测试的FL细胞系都与增加浓度的维奈托克（威托克）孵育。耐药细胞系建立后，维奈托克（威托克）对细胞存活率无明显影响。Westernblot分析显示BCL-2和BIM蛋白水平下降。随着BCL-2水平的降低，尤其是BIM蛋白水平非常有限，维奈托克（威托克）失去了诱导这些细胞凋亡所需的关键靶点和激活剂。　　

　　为了增强维奈托克（威托克）的作用并防止其在体内的快速再生长，我们研究了利妥昔单抗，一种报道的ERK1/2和AKT通路的抑制剂。与单用维奈托克（威托克）或rituximab治疗相比，该联合治疗在存活率上有显著提高，这支持了该联合治疗在FL的临床评价。　　

　　总的来说，我们使用了多种体外、体外和体内模型来证明维奈托克（威托克）在FL中的活性，这取决于BCL-2/BIM的表达比例。然而，由于获得性抵抗的建立，反应的持久性受到限制，其特征是BCL-2和BIM表达的损失。机制研究显示，JNK、AKT和ERK1/2在维奈托克（威托克）治疗中被激活，这导致了获得性耐药表型。同时抑制JNK、AKT和ERK1/2信号通路可增强维奈托克（威托克）的体外活性，有助于防止获得性耐药的建立。重要的是，这些数据部分揭示了利妥昔单抗联合维奈托克（威托克）增强FC-TxFL2异种移植瘤FL存活的机制，并支持了临床试验中对该联合的评估。最后，在没有维奈托克（威托克）的情况下，耐药性的迅速丧失也可能决定了这些试验的给药时间表。维奈托克（威托克）在老挝卖的多少钱一盒？详情请扫码咨询：