依鲁替尼/亿珂是一种高效的BTK抑制剂

　　依鲁替尼（亿珂）抑制GBM细胞的增殖　　

　　依鲁替尼（亿珂）是一种高效的BTK抑制剂，用于治疗b细胞恶性肿瘤。我们注意到，BTK在肿瘤基因组图谱(TCGA)和基因表达Omnibus(GSE7696，GSE16011)中的GBM组织表达上调。为了确定依鲁替尼（亿珂）对人脑胶质瘤细胞存活率的影响，我们采用CCK8法分析了不同浓度依鲁替尼（亿珂）处理72h后的U87、LN229、T98和U251细胞。结果表明，依鲁替尼（亿珂）降低GBM细胞存活率呈剂量依赖性。此外，细胞存活率也随着处理时间的增加而降低。为了评价依鲁替尼（亿珂）对细胞存活的长期影响，我们进行了菌落形成实验。当GBM细胞被不同浓度的依鲁替尼（亿珂）(0、5或10)处理时，观察到菌落数量显著减少。EdU掺入实验表明，依鲁替尼（亿珂）以剂量依赖的方式减弱LN229和U87细胞的增殖。流式细胞仪检测显示，GBM细胞阻滞在G0/G1期。细胞周期的进展是由细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、细胞周期蛋白(cyclins)促进的，并被CDK抑制剂(包括cyclinD1、E2F1和Rb磷酸化)抑制。据了解，cyclinD1的表达是由GSK-3细胞增殖蛋白abb0介导的。特异性抗体westernblotting检测，依鲁替尼（亿珂）暴露导致cyclinD1、E2F1和磷酸化Rb水平下降，p-GSK3蛋白的表达水平下降；这表明，抑制cyclinD1和E2F1表达以及抑制Rb和GSK3的磷酸化可能在依鲁替尼（亿珂）诱导的GBM细胞G1期阻滞中起作用。

　　

　　依鲁替尼（亿珂）抑制GBM细胞迁移，诱导细胞凋亡　　

　　GBM细胞不仅具有无限增殖能力，而且具有高迁移能力和抗凋亡能力。用伤口愈合和跨井迁移试验来检测依鲁替尼（亿珂）对细胞迁移的可能影响。在ibrutinb处理24小时后，未处理的GBM细胞(LN229和U87)划伤面积明显大于依鲁替尼（亿珂）处理的细胞。trans-well迁移实验显示，ibrutinb处理后，下室LN229或U87细胞数量显著减少，且呈剂量依赖性。采用流式细胞仪检测依鲁替尼（亿珂）对人GBM细胞凋亡的影响；依鲁替尼（亿珂）处理后，LN229和U87凋亡细胞数量增加，表明依鲁替尼（亿珂）能有效诱导GBM细胞凋亡。caspase9的激活激活caspase3，从而启动细胞凋亡，因此我们研究了caspase在依鲁替尼（亿珂）诱导的细胞凋亡中的作用。westernblotting分析显示，依鲁替尼（亿珂）处理后，caspase3和9的裂解量呈剂量依赖性增加。此外，在依鲁替尼（亿珂）处理的细胞中，抗凋亡Bcl-xL蛋白水平显著下降。　　

　　依鲁替尼（亿珂）诱导GBM细胞自噬　　

　　接下来我们研究了依鲁替尼（亿珂）处理的LN229和U87GBM细胞中自噬的发生。由于自噬体具有独特的双膜或多膜结构，透射电镜是检测自噬体形成的金标准。在LN229和U87细胞中，确实有双膜或多膜结构的积累，提示自噬体的形成。接下来我们使用特异性的LC3A/B抗体和共聚焦显微镜检查LC3A/B-i向LC3A/B-ii的转化。在LN229和U87细胞中，在使用10-20氟替尼24小时后，斑点状LC3A/B荧光强度增强。对依鲁替尼（亿珂）处理的GBM细胞裂解物的免疫印迹显示，处理后的LC3A/B-II和Atg7蛋白显著增加，且呈剂量和时间依赖性；这些蛋白是调控自噬体[21]形成的关键成分。与这些观察一致，孵育3MA，一种自噬小体形成抑制剂。依鲁替尼（亿珂）和3MA联合处理降低了LC3A/B-II水平，表明依鲁替尼（亿珂）诱导GBM细胞自噬。　　

　　依鲁替尼（亿珂）通过靶向Akt/mTOR通路诱导GBM细胞自噬　　

　　哺乳动物Akt/mTOR通路的靶点是[22]自噬的关键调控因子。既往研究表明，依鲁替尼（亿珂）通过BTK/Akt/mTOR途径[14]抑制GBM的致瘤性。我们观察到，在依鲁替尼（亿珂）处理的细胞中，磷酸化的Akt、mTOR和p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)水平显著下调，而磷酸化的unc-51样激酶1(ULK1)水平升高。接下来，我们研究了Akt/mTOR通路是否参与依鲁替尼（亿珂）诱导的LN229和U87细胞的自噬。pcDNA3-CA-Akt质粒转染细胞后过表达组成活性Akt，会降低LC3A/B-II的表达，而依鲁替尼（亿珂）处理后，这一效应增强。用PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂LY294002预处理LN229和U87细胞时，依鲁替尼（亿珂）诱导的自噬蛋白IC3A/B-II水平在LN229和U87细胞中显著升高。这些结果表明Akt/mTOR信号通路是调节依鲁替尼（亿珂）诱导的自噬的关键中介。　　

　　阻断自噬可提高依鲁替尼（亿珂）诱导的细胞死亡　　

　　许多研究表明，自噬可能是一种保护细胞反应，可以防止肿瘤细胞因治疗而死亡[23-25]。为了研究依鲁替尼（亿珂）的自噬诱导活性是否有助于其抗肿瘤活性，我们采用CCK8法比较依鲁替尼（亿珂）单独治疗和联合自噬抑制剂3MA治疗后的细胞存活率。结果显示，依鲁替尼（亿珂）/3MA共处理增强了依鲁替尼（亿珂）的细胞毒作用。为了进一步探讨自噬与依鲁替尼（亿珂）诱导的细胞死亡之间的关系，我们使用小干扰RNA沉默LN229和U87细胞中Atg7的表达。转染si-Atg7后，依鲁替尼（亿珂）处理的细胞中Atg7和LC3A/B-I/II蛋白水平显著下调。此外，si-Atg7转染增强了依鲁替尼（亿珂）诱导的细胞存活率下降。此外，Atg7的下调显著增强了依鲁替尼（亿珂）诱导的GBM细胞凋亡。这些结果表明，抑制自噬可以促进依鲁替尼（亿珂）对GBM细胞的细胞毒性作用。　　

　　依鲁替尼（亿珂）在U87异种移植瘤模型中诱导自噬并发挥抗肿瘤作用　

　　接下来，在体内评估依鲁替尼（亿珂）联合3MA的潜在应用。将植入U87细胞的小鼠随机分为4个实验组(对照组、依鲁替尼（亿珂）组、3MA组和依鲁替尼（亿珂）+3MA组)。依鲁替尼（亿珂）组和依鲁替尼（亿珂）+3MA组均有抗肿瘤作用。此外，依鲁替尼（亿珂）联合3MA似乎比依鲁替尼（亿珂）单独治疗更有效，异种移植模型证明了这一点。H&E染色未显示四组之间的组织学差异。对依鲁替尼（亿珂）组和依鲁替尼（亿珂）+3MA组的组织进行免疫组化(IHC)检查，结果显示依鲁替尼（亿珂）/3MA联合用药对ki67阳性细胞数量和LC3A/B水平的降低程度高于依鲁替尼（亿珂）单独治疗；3MA对自噬的抑制并没有导致3MA组ki67阳性细胞比对照组减少更多。数据提示，3MA联合治疗可促进依鲁替尼（亿珂）的体内抗肿瘤作用。为了进一步阐明Akt/mTOR通路在依鲁替尼（亿珂）诱导的自噬中的作用，我们通过westernblotting评估了LC3A/B、p-Akt和p-mTOR在小鼠肿瘤中的表达。在依鲁替尼（亿珂）处理过程中，p-Akt和p-mTOR水平升高，LC3A/B-II表达升高。综上所述，这些结果证实了自噬抑制促进依鲁替尼（亿珂）在GBM中的抗肿瘤活性。依鲁替尼多少钱一盒？详情请扫码咨询：