帕博西尼/哌柏西利可以抑制内源性CDK4活性

　　p27结合诱导的激酶N瓣结构改变表明帕博西尼型抑制剂对活性CDK4三聚体复合物的效价较弱。在β3在β5的“网守”残基Phe93和也Ala33从使与帕博西尼（哌柏西利）的吡啶并嘧啶骨架的C5-甲基和C6-乙酰基。我们测试了帕博西尼，瑞博替尼和玻玛西林对重组CDK4酶复合物活性的影响。如预期的那样，所有三种化合物均抑制了CDK4-CycD1二聚体的Rb771-928磷酸化。

　　活性phosp27-CDK4-CycD1三聚体对药物相对不敏感，具有约10μM或更高的明显抑制常数。我们通过等温滴定热法（ITC）测量了帕博西尼对CDK4复合物的结合亲和力。该药物仅紧密结合CDK4单体和K4D1二聚体。与我们的结构和动力学数据一致，我们未检测到对K4D1/phosp27三聚体的亲和力。我们还测量了p27与CDK4单体的结合，如果该酶首先被帕博西尼。这些数据证明p27和帕博西尼与CDK4的结合是互斥的。

　　将K4D1二聚体和phosp27-K4D1三聚体结构与结合帕博西尼的CDK6对齐，以模拟与CDK4结合时药物的位置和相互作用。在不存在和存在以下条件的情况下，使用CDK4-CycD1二聚体和phosp27-CDK4-CycD1三聚体的Rb771-928的32P-ATP磷酸化增加抑制剂浓度。

　　每种药物的剂量从0.2μM到16.2μM，以3倍为增量。帕博西尼或p27的ITC亲和力已滴定到所示酶中。所指示的细胞裂解物与对照或与p27蛋白抗体免疫沉淀，并使用免疫沉淀的活性磷酸化RB771-928与32在不存在或帕博西尼的存在P-ATP。显示了与指定的重组二聚体或三聚体酶的反应，用于在前四个泳道中进行比较。除了裂解物用针对CDK4 C-末端肽的抗血清沉淀。

　　我们测试了内源性细胞CDK4复合物的活性是否被帕博西尼抑制。我们免疫沉淀了来自MCF7，MDA-MB-231和T98G细胞的p27复合物。MCF7和MDA-MB-231细胞是Rb阳性且对帕博西尼敏感的乳腺癌细胞，其雌激素受体（ER）状态不同。T98G细胞是Rb（+）和ER胶质瘤细胞，对帕博西尼的敏感性相对较低。免疫沉淀使磷酸化的Rb771-928磷酸化；该活性对添加到激酶反应中的帕博西尼不敏感。我们认为这种对帕博西尼不敏感的活动可能来自CDK2。虽然认为带有p27的细胞CDK2复合物不活跃，但我们发现重构的K2A / phosp27复合物使Rb磷酸化。p27免疫沉淀活性也没有被CDK2抑制剂地那昔布抑制，因此该免疫沉淀可能包含CDK4活性而不是CDK2活性。现在仿制药帕博西尼效果也是十分不错，如果您有需要帕博西尼添加下方微信。