索拉非尼/索拉菲尼M2巨噬细胞通过前馈方式分泌HGF

　　索拉非尼（索拉菲尼）对于人急性单核细胞白血病细胞系THP-1和肝癌细胞系细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞银行，并经其鉴定。将THP-1细胞保存在RPMI 1640培养基中，同时将所有肝癌细胞在补充有10％胎牛血清（FBS）的DMEM中培养完全培养基，温度为37°C，5％的CO2。THP-1衍生的巨噬细胞的产生和极化过程如先前所述进行了一些修改。

　　简而言之，将10厘米培养皿中的1××107 THP-1细胞在含200μng/ml PMA的10μml完全培养基中孵育24μh，并在10μml新鲜完全培养基中再培养24μh，以产生THP-1巨噬细胞（M0）。对于M1极化，然后将巨噬细胞在含有100μng/ml LPS和20μng/ mlIFN-γ（西格玛）的10μml新鲜完全培养基中再培养24h。对于M2极化，将巨噬细胞与10μml新鲜完全培养基，20μng/mlIL-4一起培养72μh。极化后，将106个M1样和M2样巨噬细胞分别在10 μml无血清RPMI 1640培养基中培养48 μh。然后通过在1300 rpm下离心5 min收集条件培养基（CM），将上清液等分并保存在-80 C下以备后用。

　　极化后，收获THP-1衍生的巨噬细胞，并在PBS中洗涤。然后使用抗CD11b-PE-Cy7，在4°C下将1××106细胞染色30分钟。 从新鲜异种移植组织分离的1××106细胞用FITC抗小鼠F4/80，FITC抗小鼠CD206染色。将同种型匹配的IgG用作阴性对照。通过流式细胞仪分析结果。将每孔总共1××104个肿瘤细胞一式三份接种在24孔板中24 h，然后与CM孵育， 3μM索拉非尼，50μng/ml的重组人HGF或200μng/ml的抗HGF中和抗体持续48h。然后将二十微升细胞计数试剂盒8溶液添加到每个孔中。在37°C下孵育4°h后，在Bio-Rad酶标仪上测量450nm的吸光度。重复该实验至少三遍。

　　如前所述，用孔板进行集落形成分析。简而言之，将等量的不同处理细胞一式三份铺在孔板中。在37°C与5％CO2孵育15–20天后，每2–3天用新鲜的完全培养基替换每个孔中的上清液，然后用甲醇固定，将形成的细胞集落用0.5％的结晶紫染色。用于计数。重复该实验至少三遍。

　　为了确定受M1样或M2样THP-1来源的巨噬细胞影响的HCC细胞迁移，将肿瘤细胞接种在CM或无血清RPMI 1640培养基中插入孔的顶部，而含有10％FBS的培养基被放置在下室。在37°C与5％CO2孵育后，通过插入孔向下面的趋化剂迁移的肿瘤细胞在0.5％结晶紫溶液中染色10min，并用流水洗涤10min。在显微镜下捕获图像并计数迁移的细胞数。重复该实验至少三遍。如先前所述进行蛋白质印迹。一抗包括兔抗MET，pMET，ERK1/2，pERK1/2，AKT和pAKT。兔抗GAPDH一抗用作蛋白上样对照。所有测定重复至少三遍。

　　从南方医科大学实验动物中心购买了4-6周龄的雌性BALB/c裸鼠，并保持在标准的无病原体条件下。所有实验程序均已获得南方医科大学伦理委员会的批准，并根据《美国国立卫生研究院实验动物的护理和使用指南》对动物福利进行了密切监控。肿瘤异种移植基本上按照先前的描述进行。每组包含5-7只小鼠。将SMMC-7721肿瘤细胞皮下植入每只小鼠中。用公式计算肿瘤体积。当肿瘤达到100μm3体积时，每天通过口服管饲法对索拉非尼进行治疗（30μg/kg）。处死小鼠，并从分离的索拉非尼敏感性和耐药性肿瘤中分离肿瘤细胞。从第一轮异种移植组织分离的肿瘤细胞被培养。现在索拉非尼的价格是多少？在哪里购买？更多详情可咨询下方微信。