如何克服帕博西尼/哌柏西利的抗性

　　乳腺癌是女性的第一大全球癌症负担，激素受体（HR）阳性亚型约占乳腺癌的70％。不幸的是，即使细胞周期蛋白依赖性激酶4和6（CDK4 / 6）抑制剂是HR阳性/人类表皮生长因子受体2阴性亚型的高效治疗方法，几乎在所有情况下最终都获得了耐药性。在这里，我们使用帕博西尼（哌柏西利）耐药临床前模型研究了对CDK4 / 6抑制剂的耐药机制和潜在的治疗策略。

　　我们观察到细胞周期蛋白E在耐帕博西尼的细胞中显着过表达，并且在从HR阳性乳腺癌患者收集的胸腔积液样品中也证实了类似的关联。通过免疫共沉淀确认细胞周期蛋白E-CDK2相互作用后，我们证明了CDK2抑制与帕博西尼结合协同抑制小鼠中帕博西尼耐药细胞的增殖和palbociclib耐药异种移植的生长。我们还证明增强C-MYC介导的衰老是通过靶向CDK2和CDK4 / 6产生的协同作用背后的新机制。

　　此外，基于HR阳性乳腺癌患者中大规模公共基因表达数据集的CCNE1过表达与不良预后之间的显着关联，支持了细胞周期蛋白E作为治疗靶点的临床相关性。因此，我们提出细胞周期蛋白E-CDK2信号作为克服CDK4 / 6抑制剂细胞周期蛋白E相关抗性的有希望的治疗目标。

　　各种临床前研究报道，RB的细胞周期蛋白E的损失和过表达是预测性生物标记用于帕博西尼电阻。当我们比较耐帕博西尼的细胞与敏感细胞之间的细胞周期相关蛋白的表达时，我们还观察到了耐帕博西尼的细胞中cyclin E的过度表达和RB的丢失。此外，在分析癌细胞系百科全书（CCLE）数据中的38个乳腺癌细胞系中帕博西尼活性与细胞周期相关基因表达之间的关系。我们发现，帕博西尼活性低的细胞（IC50> 500 nM）具有较高的细胞周期蛋白E表达（p= 0.002）。这些结果表明，细胞周期蛋白E在介导对CDK4 / 6抑制剂的抗性中起特定作用。

　　即使在用CDK4 / 6抑制剂治疗后，HR阳性乳腺癌的最终进展也限制了该疗法在临床上的成功，强调需要确定这种获得性耐药的机制。为了探索对CDK4 / 6抑制剂的抗药性机制，我们建立了获得性帕博西利抗药性的可靠的临床前模型，该药物的IC50升高10倍，EMT过渡和细胞周期改变证明了这一点。考虑到CDK4 / 6抑制剂在HR阳性乳腺癌中的广泛应用，我们的耐药模型对于开发克服耐药性的药物将非常有价值。

　　基于该事实，即细胞周期蛋白E表达是CDK4 / 6抑制剂[抗性的生物标记，我们研究了细胞周期蛋白E-CDK2的抑制是否信令协同作用与CDK4 / 6抑制。我们用CDK2 siRNA（12.5 nM）和不同浓度的帕博西尼处理MCF7和MCF7-PR细胞。与单独抑制CDK2或CDK4 / 6相比，对CDK2和CDK4 / 6的联合抑制协同降低了MCF7（CI <1）和MCF7-PR细胞（CI <1）的细胞增殖。接下来，我们使用免疫共沉淀试验评估了CDK2和细胞周期蛋白E之间的直接相互作用。首先，为了研究对CDK2的抑制是否会破坏复合物，我们用CDK2 siRNA和加扰的siRNA对照处理了MCF7-PR细胞。我们发现，在敲除CDK2之后，细胞周期蛋白E的蛋白表达降低了（p＝ 0.048）。此外，反向CO-IP证实了细胞周期蛋白E和CDK2的相互作用。综上所述，这些结果表明抑制CDK2可以阻止细胞周期蛋白E-CDK2复合物的形成，从而抑制细胞周期蛋白E过表达的癌细胞的增殖。

　　为了确定潜在的联合抑制CDK2和CDK4 / 6协同作用的机制，我们比较了用帕博西尼，CDK2 siRNA以及两者结合治疗敏感和耐药细胞后的基因表达谱。我们观察到C-MYC在耐药细胞中显着上调（增加3.1倍；p<0.001）。有趣的是，过表达c-myc通过抑制CDK2显著抑制（2.2倍下降;p<0.001）和通过抑制CDK2和CDK4 / 6进一步抑制（3.0倍下降;p<0.001）。用qRT-PCR验证了耐帕博西尼细胞中C-MYC的过表达（MCF7-PR vs.MCF7;增加2.7倍;p<0.001; T47D-PR vs.T47D;增加2.8倍;p= 0.025）。

　　为了进一步支持CDK2在衰老中的作用，我们使用MCF7-PR细胞进行了β-半乳糖苷酶测定。正如预期的那样，与用帕博西尼处理的细胞或未经处理的对照相比，CDK2 siRNA处理的细胞显示出更高的β-半乳糖苷酶表达（p<0.001）。此外，与CDK2 siRNA处理的细胞（p<0.001）或帕博西尼处理的细胞（p<0.001）相比，联合处理的细胞显示出显着更高的β-半乳糖苷酶表达。这些观察结果表明，对CDK2的抑制降低了C-MYC的磷酸化并抑制了与衰老有关的C-MYC靶基因hTERT，从而导致癌细胞死亡。微信扫描下方二维码了解更多：