帕博西尼/哌柏西利对溶酶体腔室的短期影响

　　溶酶体内碱性分子的积累可能提高其pH值，这可能干扰溶酶体的功能。为了评估帕博西尼对溶酶体腔室的短期影响，我们用吖啶橙(AO)染色细胞。AO是一种荧光染料，其发射光谱随pH值的变化而变化:在酸性pH值下发出红色信号，如在功能性溶酶体内；在中性pH值下发出绿色信号，如在细胞质和细胞核内，它优先染色核仁。　　

　　正如所料，AO产生红细胞核周围的发现和绿色胞质弱荧光信号在正常sk-梅尔-103细胞。作为额外的对照，我们使用了两种经常用于产生溶酶体碱化的药物，即氯喹和巴非霉素A1。经氯喹处理后，核周室变为橙色，表明中度溶酶体碱化，胞质产生更强烈的绿色信号。　　

　　当细胞与导致强溶酶体碱化的巴非霉素A1孵育时，AO产生均匀的泛胞质绿色信号，包括核周区域。与氯喹或bafilomycinA1，治疗帕博西尼同一段时间(1h)并不影响AO荧光模式，即使帕博西尼是用于高浓度(4μM)，从而表明帕博西尼不明显改变溶酶体pH值，即使使用剂量高于治疗水平。　　

　　为了进一步评估溶酶体功能，我们测量了LAMP-1和p62的水平。LAMP-1是一种与溶酶体膜相关的糖蛋白，一般用于检测溶酶体含量；p62是自噬体转运蛋白，自噬体与溶酶体融合后被降解，因此p62水平与自噬通量呈负相关。经帕博西尼短时间处理(24小时)后，这些标记物没有发生显著变化。然而，在较长潜伏期(7天)后，当细胞衰老时，在帕博西利处理的细胞中观察到这两种蛋白水平显著升高，提示溶酶体含量增加，自噬通量受损。然而，重要的是，在其他诱导衰老的刺激下也观察到了这些变化。因此，溶酶体含量增加和自噬通量受损是与多种衰老相关的变化，并不是帕博西利诱导衰老所特有的。　　

　　衰老SK-Mel-103细胞吖啶橙染色或溶酶追踪仪染色，溶酶体室扩张特征明显。由于帕博西尼被困在溶酶体中，且溶酶体腔室在衰老过程中大大扩展，我们推测衰老细胞可能比正常细胞积累更多的帕博西尼。事实上，当短暂暴露于帕博西尼(分析前1小时)时，通过几种不同方式诱导的衰老细胞比同样暴露于帕博西尼的非衰老细胞呈现出更高水平的帕博西尼荧光。这可能反映了衰老细胞溶酶体腔室较大的特点。

　　用化合物处理培养细胞时，常见的做法是每隔一天用含药培养基刷新培养基，以防止药物下降。在帕博西尼的情况下，这种做法导致SK-Mel-103细胞中，帕博西尼大量累进溶酶体，溶酶体腔室平行扩张。有趣的是，连续添加帕博西尼并不影响Saos2细胞中帕博西尼（哌柏西利）的数量，也不产生溶酶体室的扩张。这表明，与非衰老细胞相比，衰老细胞的溶酶体腔室的大小可以根据帕博西尼暴露而扩大。详情请扫码咨询：