卡马替尼/capmatinib耐药的NSCLC细胞系

　　目的：　　

　　扩增的间充质-上皮过渡因子，MET，是一种受体酪氨酸激酶(RTK)，已被认为是非小细胞肺癌(NSCLC)的可给药靶点。尽管多种MET酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)正在积极开发用于MET驱动的NSCLC，但获得性耐MET-TKIs的机制尚未阐明。为了了解耐药机制和建立治疗策略，我们利用met扩增的NSCLC细胞株EBC-1建立体外模型。　　

　　材料和方法：　　

　　我们建立了卡马替尼耐药的NSCLC细胞系，并通过3'mRNA测序和人phospho-RTK阵列鉴定了其他信号通路。用定量聚合酶链反应和细胞增殖实验检测拷贝数变化；比较了亲本细胞系EBC-1和耐药细胞系对RTKs和下游效应物的激活情况。　　

　　结果：　　

　　我们发现EBC-CR1表现为表皮生长因子受体(EGFR)依赖性生长，并对不可逆的表皮生长因子受体TKI-afatinib敏感。过表达EGFR-MET异二聚体的EBC-CR2细胞对卡马替尼和afatinib的联合反应显著。此外，从通过扩增的磷酸肌醇-3激酶催化亚基(PIK3CA)激活EGFR的EBC-CR3细胞衍生的EBC-CR3细胞，对联合阿法替尼与磷酸肌醇-3激酶抑制因子BYL719的组合敏感。　　

　　结论：　　

　　我们的体外研究表明，EGFR信号的激活和/或下游效应物PIK3CA的遗传改变是耐药的非小细胞肺癌细胞系的替代耐药机制。此外，联合应用MET、EGFR和PI3K-抗氧化因子抑制剂可能是卡马替尼耐药的NSCLC患者的有效治疗策略。　　

　　在本研究中，我们观察到EGFRmRNA过表达，但没有EGFR激活突变或扩增，如上所述。这些发现表明，对卡帕替尼的常见耐药是通过MET激酶以外的信号通路的激活，而不是通过特定基因的遗传改变。此外，EGFR信号的部分或全部参与是对卡马替尼的耐药机制之一，这表明在met依赖的癌细胞中有更好的替代信号通路。　　

　　既往临床研究报道了非小细胞肺癌患者中MET的重新扩增。根据临床前和临床发现，MET扩增可能是MET-tkis的药物靶点。因此，有报道称，MET-TKIs用于多种癌症的临床前和临床试验。卡马替尼目前正处于临床试验阶段，对于met依赖性癌症是一种选择性强、有效的met特异性药物。然而，获得性耐MET-TKIs的迅速发展一直是影响疗效的关键因素。然而，迄今为止，人们对MET-TKIs的耐药机制了解不多。因此，通过分子研究确定MET-TKIs耐药的潜在机制，建立有效的治疗策略来管理获得性耐药具有重要意义。虽然体内肿瘤模型很重要，但体外肿瘤细胞系可以为研究耐药机制提供一个有价值的模型系统。在这里，我们利用这一体外策略来鉴定卡马替尼在met扩增的NSCLC细胞系中的分子耐药机制。　　

　　MET通过多种机制正向调控EGFR信号通路，因此在MET扩增的NSCLC细胞系中，选择性MET-tki、卡马替尼可降低EGFR磷酸化。据报道，EGFR信号是一种较好的MET激酶旁路机制，而EGFR-tki和MET-tki的结合可以使耐药细胞变得敏感，这在一些研究中有报道[22-24]。此外，在MET扩增性食管胃癌[25]中存在EGFR共扩增作为对其他MET激酶抑制剂耐药机制的临床证据。我们的耐药细胞系之一(EBC-CR2)也对联合治疗敏感。有趣的是，与亲本EBC-1细胞系相比，卡马替尼增加了EBC-CR2细胞系EGFR的磷酸化，并呈剂量依赖性。因此，我们推测MET和EGFR激酶可能是通过异质二聚体的形成以及主要细胞信号通路在MET和EGFR之间自由交替而被激活的。　　

　　EGFR途径主要在MET-tki存在的情况下被激活，而MET途径在EGFR-tki存在的情况下由于异二聚体相互作用而被激活。如前所述，与亲本和其他耐药细胞系相比，EBCCR2细胞表现出最多的MET-EGFR异二聚。EGFR异二聚化作为耐药机制已经在一些RTK抑制剂中被报道，但在MET-TKI中没有报道。这些结果首次表明异二聚体可能是MET-TKI的获得机制。推测MET与EGFR的物理相互作用可能促进MET-EGFR异二聚体或反式磷酸化的形成。此外，联合治疗可有效抑制细胞增殖，这支持将MET和EGFR抑制剂联合治疗作为一种治疗癌症患者MET-tki获得性耐药的潜在策略。　　

　　在亲本EBC-1细胞系中，卡马替尼抑制了EGFR磷酸化，但在EBC-CR1细胞系中没有抑制。这一结果表明EBC-CR1的EGFR信号与MET信号无关。EBC-CR1细胞的生存信号完全由MET转移到EGFR，这是因为单次使用阿法替尼有效地抑制了下游信号传导和细胞增殖。有趣的是，完全依赖egfr的EBC-CR1细胞通过在连续高浓度卡马替尼中培养PIK3CA扩增，成为EBCCR3细胞，对afatinib产生抗性。PIK3CA的基因改变经常与包括MET在内的其他致癌改变同时发生。例如，PIK3CA突变和MET外显子14跳跃突变导致MET的组成性激活，导致对MET-tkis的初级抗性。在EBC-CR3细胞中，PIK3CA的扩增可能是除MET-tki耐药外获得性对EGFR-TKI耐药的重要机制，这一点通过EBC-CR1细胞对MET激酶信号的独立性得到证实。　　

　　尽管暴露于相似的最终浓度的卡马替尼(EBC-CR2，2.2mol/L；而EBC-CR3，2.4mol/L)、EGFR/MET相互依赖的EBC-CR2细胞对卡马替尼和afatinib的联合应用始终表现出敏感性。相比之下，EBC-CR3细胞获得了额外的抗PIK3CA扩增机制。基于这一观察结果，可能的解释是EGFR-MET异二聚作用增加了细胞的遗传稳定性或有较高的阈值浓度诱导遗传变化；因此，在EBC-CR2细胞中不需要基因改变。抗癌药物通过诱导染色体脆性位点，导致扩增事件，从而促进染色体不稳定。　　

　　此外，我们观察到EBC-CR3细胞的DNA修复相关基因表达低于EBC-CR1。AKT的过度激活可能会抑制EBC-CR3细胞的DNA修复，就像之前研究的一样。然而，DNA修复相关基因是否明确参与了卡马替尼耐药尚不清楚，进一步研究DNA修复基因在卡马替尼耐药机制中的作用可能需要进一步研究。在EBC-CR2细胞中，卡马替尼对RTK抑制剂的无约束生存信号变化的影响较小。与EBC-CR2细胞相比，EBC-CR1细胞依赖于配体的激活，其对激酶抑制剂的抵抗机制不如异二聚作用稳定。因此，需要一个次要事件来增加细胞的稳定性，以对抗强大的MET抑制，并将细胞转向一个MET独立的生存信号。阿法替尼+BYL719通过下调PI3K信号下游的磷酸化AKT信号，有效抑制pik3ca扩增的EBC-CR3细胞。综上所述，尽管治疗时间或药物浓度相似，体外耐药模型显示不同耐药克隆样患者具有异质耐药机制。　　

　　综上所述，我们的研究结果表明，在met扩增的NSCLC细胞系中，单个细胞系可以发展出多种egfr依赖的MET-TKIs耐药机制。其中一种机制涉及配体和受体表达的增加。事实上，我们发现EGFR和HBEGFmRNA表达增加或MET-EGFR异质二聚体形成导致EBC-CR2细胞对联合治疗敏感，这是促进获得性耐药的机制。最有趣的发现是，通过PIK3CA扩增，卡马替尼治疗导致对卡马替尼的耐药性向对afatinib的耐药性转变。　　

　　由于肿瘤在临床环境中对MET-TKI耐药，因此在临床前和临床研究中了解tki耐药机制是很重要的。因此，我们的结果强调了在涉及激酶抑制剂的卡马替尼耐药NSCLC细胞的治疗策略中，MET、EGFR和其他改变的致癌基因(如PIK3CA)之间的关系。　　

　　未来的工作应该通过体内模型和met扩增的对卡马替尼产生耐药性的NSCLC的临床数据证明耐药机制。详情请扫码咨询: