依鲁替尼/亿珂诱导的神经炎症反应

　　为了确定使用依鲁替尼（亿珂）进行的预处理是否会在体内改变LPS诱导的神经炎症，每天对腹腔内（ip）给予依鲁替尼（10 mg/kg）或赋形剂的小鼠连续3天，然后注射LPS或PBS。注射LPS或PBS后三小时，给小鼠灌注并用4％多聚甲醛（PFA）溶液固定，然后快速冷冻大脑组织，并使用低温恒温器（35微米厚）切片。对每个脑切片进行免疫组织化学染色。用PBS冲洗脑切片，并在室温下用含0.2％Triton X-100和0.5％BSA的PBS透化1小时。随后将组织切片与第一抗Iba-1，抗GFAP，抗COX-2或抗IL-1β抗体在4°C下孵育过夜。

　　第二天，将组织切片用0.5％BSA洗涤3次，并在室温下与生物素偶联的抗兔二抗孵育1小时。然后将切片用0.5％BSA冲洗，并在抗生物素蛋白-生物素复合物溶液中于室温孵育1小时。用0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）洗涤切片3次后，通过将切片与0.5 mg/ml 3,-二氨基联苯胺在含有0.003％H2O2的0.1 M PB中孵育来检测信号。将切片用0.1 M PB冲洗并安装在明胶包被的载玻片上，并在明场显微镜（Leica）下捕获图像。使用-评估细胞活力-二苯基溴化四氮唑（MTT）分析。

　　将BV2小胶质细胞接种在96孔板中，并在不存在FBS的情况下，用各种浓度的依鲁替尼处理24小时。然后将细胞用0.5 mg/ml MTT处理，并在5％CO2培养箱中于37°C孵育3小时。在580nm处测量吸光度。从1日龄的Sprague-Dawley大鼠的大脑皮层中培养大鼠原代混合神经胶质细胞。简而言之，将皮质在含有10％FBS /青霉素-链霉素溶液（5000单位/ ml青霉素，5mg/ml链霉素）的高葡萄糖DMEM中研磨成单细胞，并铺板放入75 T烧瓶（0.5半球/烧瓶）中放置2周。

　　为了收获大鼠原代小胶质细胞，将烧瓶以120 rpm的速度连续摇动2h，以促进小胶质细胞从烧瓶中脱离。随后收集液体培养基，并以1500 rpm离心15分钟，然后将细胞沉淀重悬于板中，每孔培养1××105个细胞。使用0.1％胰蛋白酶收获烧瓶中剩余的细胞以获得原代星形胶质细胞。将这些原代星形胶质细胞和原代小胶质细胞在预先涂有聚-d-赖氨酸的12孔板中培养.BV2小胶质细胞用4％多聚甲醛固定10分钟，用PBS洗涤3次，然后在GDB缓冲液（0.1％明胶，0.3％Triton X-100、16 mM磷酸钠，pH 7.4和450 mM）中与抗CD11b和抗IL-1β或抗CD11b和抗COX-2抗体一起孵育NaCl）在4°C下过夜。

　　第二天，将细胞用PBS洗涤3次，并与以下第二抗体在室温下孵育1小时：Alexa Fluor 488偶联的抗小鼠和Alexa Fluor 555偶联的抗兔。将细胞安装在含DAPI的溶液中，并使用共聚焦显微镜从单个平面捕获图像，并使用ImageJ软件进行分析。使用6-10张独立图像以盲法分析样品。为了检查依鲁替尼是否会影响IL-1β水平，我们进行了酶联免疫吸附试验（ELISA）。简而言之，将BV2小胶质细胞用依鲁替尼（500 nM）或溶媒（1％DMSO）处理30分钟，用LPS（100ng/ml）或PBS处理24小时。

　　然后使用条件培养基进行IL-1βELISA。根据制造商的建议，使用了小鼠IL-1βELISA试剂盒。重组小鼠IL-1β蛋白用作标准。使用酶标仪在450 nm处测量样品的吸光度。为了确定依鲁替尼是否会影响ERK，P38，JNK和AKT信号传导，将BV2小胶质细胞用依鲁替尼（1μM）或溶媒（1％DMSO）1小时，然后LPS（1μg/ ml）或PBS 45分钟。最后的温育后，将细胞用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂片剂的RIPA缓冲液裂解。如前所述进行蛋白质印迹分析，并使用Fusion软件或ImageJ软件分析图像。如前所述进行伤口愈合分析。简而言之，看到了BV2小胶质细胞。现在依鲁替尼的价格是多少？更多详情可咨询下方微信。