维奈托克/威托克作为单一药剂在5个被测细胞系中具有活性

　　虽然获得功能突变通常是AML发病过程中的次要事件，但是维持AML所必需的，因此是极具吸引力的治疗靶点。33虽然MEK抑制剂作为单一药物在AML中表现出有限的活性，临床前研究显示，MEK抑制后通过抑制MCL1协同诱导AML细胞凋亡　　

　　在本研究中，11个AML细胞系中有5个对cobimetinib敏感，其中2个存在FLT3-ITD突变(MOLM14和MV4；11)，1个存在NRAS突变(OCI-AML3)。与之前的报道一致，ERK磷酸化的基线水平与对cobimetinib的反应无关。维奈托克（威托克）作为单一药剂在5个被测细胞系中具有活性，而与cobimetinib联合在7个被测细胞系中具有协同作用，包括对每种药剂单独耐药的细胞系。　　

　　为了扩展我们在细胞系上的初步发现，我们研究了一组基因多样的原发性AML患者样本。维奈托克（威托克）仅在3个样本(16.7%)中诱导了明显的凋亡(>50%)，这一比率与维奈托克（威托克）单药治疗的临床反应(19%)相似，可能反映了肿瘤微环境的保护特性，因为我们的培养条件是细胞因子丰富的。Cobimetinib在所有AML样本中诱导的细胞死亡非常有限，这与之前报道的MEK抑制剂优先抑制增殖和促进分化，而不是诱导死亡一致。值得注意的是，超过60%的患者样本对联合治疗有反应，值得注意的是包括单独对两种药物都不敏感的样本。此外，这些应答者携带多种影响白血病细胞增殖(FLT3，RAS)、分化(RUNX1)、基因组稳定性(NPM1)和表观遗传修饰(TET2，IDH1和IDH2)的基因改变。克隆试验表明，联合应用显著损害AML祖细胞的集落形成功能，而正常祖细胞仅受轻微影响。　

　　CyTOF已被证明是一种在单细胞水平上识别不同细胞群中功能蛋白的有效方法。与CD34−细胞相比，BCL2在CD34+干细胞/祖细胞中高表达，这说明了抑制BCL2以消除LSC的必要性。维奈托克（威托克）敏感样品BCL2蛋白水平高于抗性样品。Cobimetinib抑制g-csf诱导的pERK，而不考虑反应状态。　　

　　AML细胞系和患者样本中不同的反应模式促使我们使用蛋白质组和转录组分析寻找与药物反应相关的额外药效学标志物。与MEK抑制的广泛研究结果一致，20我们观察到对MEK抑制的pMEK信号通路的旁路诱导，这在cobimetinib耐药细胞系中更为明显。在cobimetinib敏感细胞系中，pS6、pERK、p38MAPK和pPTEN等多条信号通路被高度激活。Lauchle和同事证明，对MEK抑制具有预先抗性的白血病克隆表现出p38激酶活性降低和RasGRP1水平升高。13先前也有报道称，MAPK下游的RSK信号通路调控了一条不依赖于mtor的通路来诱导S6磷酸化。结果显示，在cobimetinib敏感的OCI-AML3和MV4-11细胞中，S6Ser235/236和Ser240/244位点的磷酸化均被显著抑制。　　

　　在OCI-AML3细胞中，联合治疗导致了以PARP裂解水平升高为特征的显著细胞死亡，这可能是由于BCL2:BIM复合体的破坏，释放BIM触发细胞凋亡。我们还观察到了BIM在MV4-11细胞中的诱导作用，强调了BIM在BCL2和MEK抑制剂联合使用时的作用。虽然RPPA数据显示，在cobimetinib处理后MCL1未被调节，但westernblot和MesoScale发现检测显示，在OCL-AML3细胞中MCL1下调，而在维奈托克（威托克）处理后MCL1上调。这些数据表明，维奈托克（威托克）诱导的MCL1水平升高有利于MCL1的形成:BIM复合体被破坏，释放BIM引发细胞凋亡。与这些发现相一致的是，我们最近发现，与MDM2抑制相关的mcl1降解是通过MEK/ERK抑制和GSK3激活而发生的。　　

　　cobimetinib对MYC水平的下调也表明存在MEK/ERK-GSK3手链，因为MYC的泛素化和降解需要通过GSK3的连接在T58位点磷酸化。46此外，RNA测序分析显示，细胞中MYC和E2F靶基因表达增强，显示出对cobimetinib-维奈托克（威托克）组合的协同反应。这一发现与之前的报道一致，即MEK抑制通过促进G1细胞周期阻滞使细胞对abt-263诱导的细胞凋亡敏感。37已知糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)是通过rnk126介导的丙酮酸脱氢酶激酶泛素化调控的。通过联合抑制BCL2、OXPHOS和MAPK信号，已经证明了在黑色素瘤细胞中具有强大的抗肿瘤作用。47个通过转录组分析发现的p53和UPR通路的改变可能也解释了MEK和BCL2抑制的协同作用。这些拟议的行动机制概述在网上补充图S10中。然而，这些模型还需要在受控机理研究中进一步验证。　　

　　通过OCI-AML3(对维奈托克（威托克）耐药)和MOLM13(对cobimetinib耐药)白血病细胞建立的体内模型，进一步证实了cobimetinib和维奈托克（威托克）联合用药的效力。虽然我们在体外观察到两种细胞系的强协同效应，但在体内模型中，联合用药并没有带来显著的生存益处。这可能是由于微环境提供了对细胞死亡的保护，正如我们在细胞因子丰富的培养基中培养的患者样本中观察到的那样。与我们的体外观察相似，OCI-AML3异种移植物模型对cobimetinib过敏，我们发现单药组和联合用药组的存活率没有显著差异。在极具侵袭性的MOLM13模型中，未经治疗的小鼠在细胞注射后3周死亡，在第17天，联合用药降低了白血病负担，但没有明显消除。　　

　　综上所述，联合阻断MAPK和BCL2通路可促进大多数原发性AML细胞的死亡和抑制细胞增殖。这种抗白血病效果与维奈托克（威托克）同时抑制BCL2和cobimetinib介导的下调MCL1有关，这两种作用共同促进了促死蛋白BIM的释放。这些临床前数据为评估cobimetinib和维奈托克（威托克）在一项纳入复发/难治性AML(NCT02670044)的老年患者的I期临床试验(临床前数据包括客观的临床反应)提供了强有力的机制基础。详情请扫码咨询：