达可替尼/多泽润在免疫组织中的化学研究

　　第二代酪氨酸激酶抑制剂达可替尼（多泽润）是不可逆的抑制剂，与EGFR和其他ErbB家族受体的激酶结构域形成共价键。达可替尼已被批准用于治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌。在这项研究中，我们旨在开发一种免疫组织化学，以检测达克替尼-ErbB家族受体偶联物。单次口服达科替尼的剂量后，在回肠和结肠中24小时后观察到强烈的染色，而在十二指肠和空肠中只有轻微的染色。在皮肤中，在表皮，毛囊和皮脂腺中观察到强烈的染色。此外，回肠，结肠和皮肤给药后最多72小时仍保留大量达科替尼。该报告是第一个阐明达科替尼在大鼠肠道和皮肤中的定位和积累的报告，在阐明达科替尼引起的腹泻或皮肤毒性的机理研究中应该是有价值的。

　　第二代口服和不可逆泛HER酪氨酸激酶抑制剂（TKI）达可替尼和阿法具有非常相似的化学结构和选择性结合的ATP结合[EGFR的口袋。这些第二代不可逆TKI在临床上被认为优于第一代可逆TKI，因为它们可能同时阻断多种受体的活性并持续更长的时间。在另一方面，第二代TKI 达可替尼抑制健康组织正常EGFRs更强烈比第一代的TKI，导致皮疹，痤疮，和腹泻。迄今为止，尚未对这些副作用进行研究，其潜在机制仍知之甚少。

　　达可替尼并与ErbB家族受体阿法形成共价键在体内。因此，我们开发了针对阿法和免疫组化（IHC）系统中的特定抗体，可以检测组织中EGFR结合的阿法。使用该IHC系统，我们首次揭示了阿法替尼在肠道和皮肤中的定位。我们还发现阿法替尼与EFGR大致共定位。但是，达可替尼在肠道和皮肤中的定位仍不清楚，尽管据预测与阿法替尼相似。至关重要的是揭示达科替尼在肠道和皮肤中的精确定位，以研究达科替尼引起的腹泻和皮肤毒性的潜在机制。

　　阿法替尼和达可替尼具有非常相似的化学结构。基于其特异性谱，我们先前开发的抗阿法替尼血清可能与达科替尼发生交叉反应。因此，在本研究中，我们试图开发一种使用抗阿法替尼血清检测达科替尼的IHC系统，以揭示口服达科替尼在肠道和皮肤中的定位，从而阐明达科替尼引起的腹泻和皮肤毒性的机制。

　　达科替尼单次口服给药后24小时，在回肠，结肠和皮肤中进行了两个不同的阴性对照实验，常规对照实验和吸收对照实验。在常规对照中，将切片暴露于正常小鼠血清（1：1000）而不是原发抗阿法替尼血清。在吸收对照中，在与切片反应之前，先用10μg/ mL达可替尼预先稀释稀释的抗阿法替尼一级血清。

　　我们先前产生了一种抗阿法替尼的特异性抗体，该抗体识别除其4--2-丁烯部分以外的结构。阿法替尼的结构与达可替尼。图中显示了达可替尼和阿法替尼与抗阿法替尼血清的剂量反应曲线。抗阿法替尼血清显示出与达克替尼的约15％交叉反应性。该结果表明抗阿法替尼血清可用于分析达克替尼。因此，抗阿法替尼血清被用作IHC中抗达科米替尼血清。

　　达可替尼和阿法替尼的结构包含α，β-不饱和酮部分，可以用作迈克尔反应的受体分子。这些药物的α，β-不饱和酮部分与蛋白质（例如巯基或氨基）的富电子部分形成共价键。因此，这些药物通过与EGFR或其他蛋白质形成共价键而定位在组织中。达可替尼和阿法替尼都是TKI通过与ErbB家族受体共价键结合起作用；因此，我们预测达可替尼和阿法替尼在肠道和皮肤中的定位相似。但是，达可替尼在肠道和皮肤中的定位尚未发现。因此，使用阿法替尼血清开发了用于达克替尼的IHC，并阐明了达可替尼在大鼠肠和皮肤中的定位和积累。